ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ — Что такое ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ?

Слово состоит из 14 букв:

первая ф,

вторая л,

третья у,

четвёртая о,

пятая р,

шестая е,

седьмая с,

восьмая ц,

девятая е,

десятая н,

одиннадцатая т,

двенадцатая н,

тринадцатая ы,

последняя й,

Слово флуоресцентный английскими буквами(транслитом) — florestsentnyi

• Буква ф встречается 1 раз. Слова с 1 буквой ф
• Буква л встречается 1 раз. Слова с 1 буквой л
• Буква у встречается 1 раз. Слова с 1 буквой у
• Буква о встречается 1 раз. Слова с 1 буквой о
• Буква р встречается 1 раз. Слова с 1 буквой р
• Буква е встречается 2 раза. Слова с 2 буквами е
• Буква с встречается 1 раз. Слова с 1 буквой с
• Буква ц встречается 1 раз. Слова с 1 буквой ц
• Буква н встречается 2 раза. Слова с 2 буквами н
• Буква т встречается 1 раз. Слова с 1 буквой т
• Буква ы встречается 1 раз. Слова с 1 буквой ы
• Буква й встречается 1 раз. Слова с 1 буквой й

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ (флуоресцирующие красители), обладают способностью флуоресцировать, т.е. превращать поглощенный свет в более длинноволновое видимое излучение..

Химическая энциклопедия

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ КРАСИТЕЛИ (флуоресцирующие красители), обладают способностью флуоресцировать, т. е. превращать поглощенный свет в более длинноволновое видимое излучение.

Химическая энциклопедия. — 1988

Флуоресцентная наноскопия

Флуоресцентная наноскопия Термин флуоресцентная наноскопия Термин на английском fluorescence nanoscopy Синонимы Аббревиатуры TIRFM, 4Pi, I5M, I5S, STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, PALM, STORM, PAINT Связанные термины конфокальная микроскопия…

Энциклопедический словарь нанотехнологий. — 2010

Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия Термин флуоресцентная микроскопия Термин на английском fluorescence microscopy Синонимы Аббревиатуры Связанные термины биосенсор, клетка, конфокальная микроскопия, флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения…

Энциклопедический словарь нанотехнологий. — 2010

Флуоресцентная микроскопия — метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбуждённых атомов и молекул образца. В флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой…

ru.wikipedia.org

Флуоресцентная микроскопия, то же, что люминесцентная микроскопия. См. также Микроскоп [метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия)] и Люминесцентный анализ.

БСЭ. — 1969—1978

Флуоресцентный многоуровневый диск

Флуоресцентный многоуровневый диск (FMD) — формат оптического носителя, разработанный компанией «Constellation 3D», использующий флуоресценцию вместо отражения для хранения данных.

ru.wikipedia.org

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения Термин флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения Термин на английском total internal reflection fluorescence microscopy Синонимы Аббревиатуры TIRFM Связанные термины клетка…

Энциклопедический словарь нанотехнологий. — 2010

КРАСКА ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ

КРАСКА ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ специальный вид печатных люминесцентных красок с особыми химическими примесями, светящихся под воздействием лучей определенного спектра.

Большой филателистический словарь. — 1988

Жёлтый флуоресцентный белок

Жёлтый флуоресцентный белок (англ. Yellow Fluorescent Protein) — генетическая мутантная форма зелёного флуоресцентного белка (GFP), выделенного из медузы эквореи Aequorea victoria.

ru.wikipedia.org

АТОМНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

АТОМНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (атомно-флуоресцентная спектрометрия), метод количеств. элементного анализа по атомным спектрам флуоресценции. Пробу анализируемого в-ва превращают в атомный пар и облучают для возбуждения флуоресценции таким излучением…

Химическая энциклопедия

АТОМНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (атомно-флуоресцентная спектрометрия), метод количеств. элементного анализа по атомным спектрам флуоресценции. Пробу анализируемого в-ва превращают в атомный пар и облучают для возбуждения флуоресценции таким излучением…

Химическая энциклопедия. — 1988

Зелёный флуоресцентный белок

Зелёный флуоресцентный белок (англ. green fluorescent protein, GFP) — белок, выделенный из медузы Aequorea victoria, который флуоресцирует в зелёном диапазоне при освещении его синим светом.

ru.wikipedia.org

Русский язык

Флуоресц/е́нт/н/ый и флюоресц/е́нт/н/ый.

Морфемно-орфографический словарь. — 2002

• Слова из слова «флуоресцентный»
• Слова на букву «ф»
• Слова, начинающиеся на «фл»
• Слова c буквой «й» на конце
• Слова c «ый» на конце
• Слова, начинающиеся на «флу»
• Слова, начинающиеся на «флуо»
• Слова, оканчивающиеся на «ный»
• Слова, заканчивающиеся на «тный»

1. флуктуируют
2. флуктуирующий
3. флуоресцеин
4. флуоресцентный
5. флуоресценция
6. флуоресцировавший
7. флуоресцировать

Флуоресцентные репортеры и их репортажи

Е.  О. Пучков,
доктор биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН
«Химия и жизнь» №9, 2014

Как известно, однажды свет был успешно отделен от тьмы. С тем, что такое тьма, еще предстоит разобраться: пока наметились лишь некоторые перспективы в связи с изучением темной материи и темной энергии. А вот свет человечество давно изучает и использует, в том числе и как исследовательский инструмент.

В последние тридцать лет стремительно растет число методов исследования, основанных на регистрации флуоресценции, и они все шире применяются в биологии и медицине. Обусловлено это как развитием техники, в первую очередь компьютеров и лазеров, так и появлением широкого спектра доступных флуоресцирующих молекул и молекулярных комплексов, так называемых флуоресцентных репортеров. Флуоресцентная методология благодаря высокой чувствительности и сравнительной безопасности вытеснила многие традиционные методы, связанные с применением радиоактивных веществ. Методы флуоресцентного анализа используются как в фундаментальных исследованиях для получения новых знаний о живом, так и в прикладных работах — в биотехнологии, медицинской диагностике, криминалистике… Что же представляют собой флуоресцентные репортеры? Какую информацию из глубин микромира можно получить с их помощью? Как эту информацию регистрируют и анализируют? Но прежде всего — что такое флуоресценция?

Флуоресценция: свечение, индуцированное светом

Некоторые вещества после поглощения света в определенном диапазоне длин волн начинают излучать свет в другом, более длинноволновом диапазоне. Давно было замечено, что растворы некоторых органических соединений и минералов изменяют цвет, если наблюдать их не на просвет, а под углом к проходящему свету. Так, например, шотландский натуралист Дэвид Брюстер в 1833 году заметил, что от зеленого спиртового раствора хлорофилла при освещении белым светом «отражается» красный свет. Позднее, в 1845 году, знаменитый астроном и физик Джон Гершель описал появление голубой окраски у бесцветного раствора сульфата хинина при облучении солнечным светом. В 1852 году математик и физик Джордж Стокс обнаружил видимое глазом свечение минерала флуорита при его облучении невидимым ультрафиолетовым излучением. «В честь» флуорита он назвал это явление флуоресценцией, по аналогии с термином «опалесценция», описывающим явление дихроизма в опале. (Опалесценция — это разновидность дихроизма: рассеяние света, которое иногда сопровождается интерференцией. Хотя опалы тоже выглядят желтоватыми в проходящем свете и голубоватыми — в рассеянном, перпендикулярном к проходящему, это не флуоресценция.)

Флуоресценция — один из видов люминесценции. Этим термином описывают все виды излучения, вызванного возбуждением молекул различными факторами. Так, например, в некоторых химических реакциях возникает хемилюминесценция. Хемилюминесценцию в биологических объектах называют биолюминесценцией. Есть вещества, которые испускают свет при возбуждении электрическим током (электролюминесценция), быстрыми электронами (катодолюминесценция), Y-излучением (радиолюминесценция) и другие. В этом контексте флуоресценция относится к категории фотолюминесценции.

Способные флуоресцировать атомы, молекулы и молекулярные комплексы называют флуорофорами, или флуорохромами. Иногда флуорохромами называют все виды флуоресцирующих молекул, а флуорофорами — только флуоресцирующие компоненты (группировки) крупной молекулы. Однако дальше мы будем использовать термин «флуорофор» для всех типов флуоресцирующих веществ. Отметим также, что в исследовательской практике ковалентно присоединенный к макромолекуле флуоресцирующий компонент принято называть флуоресцентной меткой, а свободный флуорофор — зондом. Применяемые в микроскопии флуорофоры традиционно именуют флуоресцентными красителями. Наконец, флуорофоры, используемые в биологических исследованиях, некоторые авторы стали называть биосенсорами. Физическую природу флуоресценции удобно проиллюстрировать, пользуясь диаграммой, которую предложил польский физик Александр Яблонский в 1933 году и которая носит его имя (рис.  1).

Отметим три важных обстоятельства. Во-первых, вероятности переходов, показанных на рис. 1, различаются. О вероятности можно судить по времени, за которое осуществляется каждый из переходов, или по времени пребывания электронов в каждом из этих состояний (см. таблицу): чем меньше время, тем более вероятен данный переход. Очевидно, что флуоресценция и тем более фосфоресценция — маловероятные процессы. Вот почему большинство флуорофоров светятся слабо даже при интенсивном облучении. Во-вторых, поскольку флуоресценция возможна при переходе электронов в основное состояние только с самого низкого синглетного уровня, энергия излучения меньше поглощенной энергии. Поэтому спектр флуоресценции флуорофора всегда находится в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения. И наконец, в-третьих, состояние электронов, участвующих в процессах, зависит как от физических факторов окружающей среды, так и от общей электронной конфигурации молекулы. Именно это обстоятельство и делает флуорохром молекулярным репортером, который на языке флуоресценции сообщает о физико-химических условиях своего окружения. Молекулярный репортер, в отличие от газетного репортёра, произносится с ударением на второй слог. Но задачи перед ними стоят сходные: проникнуть туда, куда поручили, и отправить репортаж с места событий.

Времена потенциальных переходов электронов между разными энергетическими состояниями в флуорофорах

Язык флуоресцентных репортеров

Итак, параметры флуоресценции — язык, с помощью которого флуоресцентный репортер передает информацию. Если продолжить аналогию, то параметры подобно словам приобретают смысл только в контексте, иначе говоря, с учетом условий регистрации. У каждого флуорофора имеется пять ключевых характеристик: спектры поглощения и флуоресценции, а также квантовый выход, время жизни и анизотропия флуоресценции.

Спектры поглощения и флуоресценции показывают, свет с какими длинами волн преимущественно поглощает и излучает данное вещество (рис. 2). Основные параметры спектра — интенсивность флуоресценции, положение максимума и так называемая полуширина (ширина спектра на уровне половины максимума). Можно считать, что максимум спектра флуоресценции — это ее цвет, например, если максимум около 540 нм, это означает, что свечение в данных условиях будет зеленым. Оговорка про условия не случайна. Часто именно эти параметры информируют наблюдателя о свойствах окружения, в котором находится репортер. Так, в спектре флуоресценции многих флуорохромов возникают характерные изменения при сдвиге рН среды. Если такие изменения могут быть вызваны только изменениями кислотности и ничем иным, то флуорофор может быть своего рода молекулярным рН-метром — рН-репортером. Характерный пример — Lyso Sensor^TM Yellow/Blue, чьи спектры показаны на рис. 3.

Квантовый выход флуоресценции — это характеристика эффективности, с которой поглощенная энергия трансформируется в излучение по сравнению с процессами безызлучательной релаксации. Количественно он определяется как отношение числа высвеченных фотонов к числу поглощенных. Чем больше квантовый выход, тем больше интенсивность свечения флуорофора. Флуоресцентный репортер часто выбирают именно по этому показателю. Например, флуоресцеин с квантовым выходом около 0,9 (почти единица!) широко применяют как в роли самостоятельного зонда, так и в качестве флуоресцентной метки нефлуоресцирующих молекул. Важно также и то, что этот показатель очень чувствителен к физико-химическим взаимодействиям репортера.

Время жизни флуоресценции — усредненное время, в течение которого молекулы флуорофоров находятся в возбужденном состоянии перед испусканием фотонов. Измеряют этот показатель по затуханию флуоресценции после кратковременного возбуждения. Время жизни флуоресценции, с одной стороны, очень чувствительно к физико-химической «обстановке», в которой находится репортер. С другой стороны, у каждого флуорофора это время свое, что позволяет получать репортажи из одного образца от флуоресцирующих молекул с похожими спектральными характеристиками. Приходя в разное время, сигналы не перекрываются.

Наконец, анизотропия флуоресценции — количественная характеристика зависимости поляризации флуоресценции от поляризации возбуждающего света. По анизотропии можно судить о вращательной подвижности репортера и тем самым о вязкости среды в его микроокружении.

Но информационные возможности флуоресцентных репортеров этим не ограничиваются. Так, например, существует явление безызлучательной, или резонансной, передачи энергии (БПЭ) от одного флуорофора на другой. При этом интенсивность флуоресценции у донора энергии уменьшается, а у акцептора возрастает. Передача возможна между флуорофорами с определенными спектральными свойствами — и, что особенно важно, находящимися на достаточно близком расстоянии. Это позволяет выявлять взаимодействие молекул и даже оценивать расстояние между ними. Вот почему БПЭ иногда называют «молекулярной линейкой».

Интересные возможности исследователям предоставляет тушение флуоресценции при физическом взаимодействии флуорофора с молекулами-тушителями, такими, как кислород, галогены, амины, некоторые электрондефицитные органические молекулы. В этом случае флуоресцентный репортер сообщает о присутствии в его окружении определенных тушителей.

Тушение флуорофора может происходить также за счет фотообесцвечивания под влиянием излучения большой интенсивности. Обычно это явление мешает экспериментатору, но в умелых руках может стать специальным методическим приемом. Так, наблюдение за восстановлением флуоресценции флуорофора после фотообесцвечивания дает информацию о вязкости и диффузионных свойств цитоплазмы. В небольшом участке клетки, содержащей флуорофор, его обесцвечивают кратковременной мощной вспышкой лазера, а затем наблюдают, как флуоресценция восстанавливается за счет диффузии необесцвеченных молекул из других участков клетки.

Какие они, флуоресцентные репортеры?

Условно можно выделить две группы репортеров, созданных на основе органических и неорганических флуорофоров.

Органические флуорофоры наиболее многочисленны и разнообразны. Как велико это разнообразие, можно представить, заглянув в каталог фирмы «Molecular Probes», специализирующейся на разработке и производстве флуорофоров c 1975 года. На момент написания статьи по ссылке было уже одиннадцатое обновление каталога: темпы роста в этой области впечатляют.

У каждого репортера — своя специализация: достоинства и возможности каждого определяют круг задач, для решения которых его применяют. Проиллюстрируем это на примере флуоресцеина и его производных (рис. 4). Как уже отмечалось, этот флуорофор имеет высокий квантовый выход и соответственно яркую флуоресценцию. Он может быть репортером рН, однако для измерения рН внутри клеток он не подходит, так как не проникает через цитоплазматическую мембрану. Зато мембрану может преодолеть его гидрофобное производное — флуоресцеиндиацетат. Правда, ацетильные группы лишают его возможности флуоресцировать, но внутри клетки их отщепляют ферменты эстеразы. Аналогичным образом (в форме диацетата) доставляется в клетки дихлорфлуоресцеин, который служит для регистрации в клетках активных форм кислорода. Если присоединить к молекуле флуоресцеина изотиоцианатную группу, такой флуорохром будет связываться с аминогруппами нефлуоресцирующих молекул. Таким образом делают флуоресцирующие антитела, стрептавидин (реагент на биотин), а также нуклеотиды и олигонуклеотиды. Наконец, 5-карбоксиметокси-2-нитробензиловый эфир флуоресцеина (не показан на рис. 4) сам не флуоресцирует, но превращается в обычный флуоресцеин при облучении светом с длиной волны 355 нм.

В 70-х годах ХХ века при изучении биолюминесценции медузы Aequorea victoria были выделены два белка, участвующих в этом процессе. Они всем известны с тех пор, как Нобелевскую премию по химии 2008 года получили их открыватели и создатели исследовательских инструментов на их основе — Осаму Шимомура, Мартин Челфи и Роджер Тсиен (см. «Химию и жизнь», 2008, №12), Один из этих белков, экворин, в присутствии ионов кальция окисляет свою простетическую группу, причем возникает хемилюминесценция голубого цвета; второй белок поглощает голубой свет и флуоресцирует зеленым.

Этому второму белку, названному просто green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок — GFP, или ЗФБ), суждена была громкая слава. После открытия GFP начались интенсивные исследования его структуры, был клонирован его ген. Оказалось, что этот ген сравнительно несложно экспрессировать в клетках других организмов. Можно также соединить его с геном другого белка и внедрить этот гибридный ген в клетку — тогда она начнет синтезировать белок с флуоресцентной меткой. Позднее у некоторых морских беспозвоночных (кораллов и полипов) обнаружили аналогичные белки с другими спектрами флуоресценции. Методы молекулярной биологии позволили сконструировать гены, кодирующие модифицированные формы флуоресцентных белков с широким диапазоном спектральных характеристик, а также фоторегулируемые варианты, свечение которых можно включать и выключать с помощью ультрафиолетового излучения. Сегодня к услугам исследователей на основе GFP созданы флуоресцентные белки всех цветов радуги, с самыми разнообразными свойствами, и постоянно появляются новые.

Несколько скромнее пока выглядит судьба экворина. Изучение зависимости его хемилюминесценции от ионов кальция позволило разработать методики измерения концентрации Ca²⁺ в некоторых клетках. Для этого существуют и флуоресцентные репортеры, однако хемилюминесцентный метод с использованием экворина не требует облучения, возбуждающего флуоресценцию, которое не всегда безвредно для биологической системы. Экворин относят к сравнительно большой группе люциферинов — веществ, ответственных за био(хеми)люминесценцию у некоторых морских и наземных организмов. Они интересны не только с точки зрения их практического применения: ведь до сих пор идут споры о том, зачем биологическим объектам вообще нужна биолюминесценция.

Неорганические флуорофоры чаще всего используют в составе так называемых биоконъюгатов — комплексов с органическими соединениями или биомолекулами. Многие атомы, например, переходные металлы, лантаниды (точнее, их ионы, например Tb³⁺ и Eu³), кластеры из нескольких атомов золота и серебра, в составе таких комплексов приобретают способность к сенсибилизированной флуоресценции. Энергия света, поглощенного органическим соединением, передается на атом неорганического элемента, который и излучает флуоресценцию. Важно то, что молекулы — доноры энергии передают ее от электронов, находящихся в триплетном состоянии. Поэтому излучение неорганических флуорофоров в таком комплексе замедленно по сравнению с обычной флуоресценцией, поскольку время жизни электронов в триплетном состоянии заметно больше, чем в синглетном (см. таблицу 1). Кроме того, спектры флуоресценции неорганических биоконъюгатов имеют небольшую ширину и сильно сдвинуты относительно спектров поглощения. Благодаря этому неорганические био-конъюгаты можно использовать и тогда, когда в исследуемой системе присутствуют другие компоненты, флуоресцирующие в том же диапазоне длин волн.

Особое место в этой группе занимают репортеры-биоконъюгаты, в которых в качестве флуорофора используются полупроводниковые кристаллы размером 2–10 нм (нанокристаллы), получившие название квантовых точек — quantum dots. Как правило, они состоят из пары элементов III/V (например, CdS, CdSe, ZnS) или II/VI групп (например, GaN, InP, InAs). Из-за малых размеров полупроводниковых кристаллов (в них всего по 10–50 атомов!) для электронов создаются условия квантованных энергетических переходов, подобных тем, что существуют в отдельных атомах. (Квантовые точки иногда даже называют «искусственными атомами».) При этом энергия переходов, а тем самым и длина волны флуоресценции зависят от размера кристалла. Чем меньше кристалл, тем больше энергия излучения, то есть меньше длина волны флуоресценции (см. фото на первой врезке). Это свойство открывает возможность создания квантовых точек практически с любой спектральной конфигурацией. Добавим, что по сравнению с органическими флуорофорами они обладают более высоким квантовым выходом и фотостабильностью. На рис. 5 показаны примерные размеры различных флуорофоров-репортеров.

Биоконъюгаты на основе квантовых точек состоят из ядра (например, CdSe), которое покрыто слоем полупроводникового материала (например, ZnS), выполняющим защитную функцию, и лиганда — какого-нибудь органического вещества, обеспечивающего растворимость и/или присоединение биологических молекул. Биоорганическая оболочка обеспечивает стабильность биоконъюгата как коллоидной частицы и формирует задание репортера, его назначение: где и с чем провзаимодействовать, какую собрать и передать информацию. При этом, конечно, размеры репортера на основе квантовой точки могут существенно увеличиться (рис.  5). В биоорганическую оболочку включают и низкомолекулярные соединения, такие, как биотин, и высокомолекулярные — одноцепочечные фрагменты ДНК, белки, в том числе ферменты или антитела (IgG).

Как читают флуоресцентные репортажи…

Первым в списке инструментов для получения и анализа сообщений флуоресцентных репортеров был человеческий глаз. Флуоресцентное свечение макроскопических объектов мы наблюдаем непосредственно, а микроскопических — с помощью флуоресцентного (люминесцентного) микроскопа. Примерами макроскопических объектов могут служить колонии микроорганизмов, в которых экспрессированы флуоресцентные белки, или хроматограммы и электрофореграммы с применением флуоресцентных красителей. В обычный флуоресцентный микроскоп (о необычных микроскопах — см. врез ниже), как правило, заглядывают для выявления иммунологических реакций с использованием меченных флуорофорами антител, применяют их и в некоторых исследованиях на уровне единичных клеток.

Особо отметим эстетическую информативность этих методов. Флуоресцентные репортеры на микрофотографиях открывают нам чарующий мир разнообразных цветов и форм (см. фото на второй странице обложки). Фирмы-производители микроскопов «Nikon» и «Olympus» даже проводят ежегодные конкурсы фоторабот о микромире в свете флуоресценции (работы-победители см. на сайтах The Olympus BioScapes Competition и Nikon’s Small World.

В отличие от флуоресцентных микроскопов, проточные цитометры не дают возможности полюбоваться флуоресцирующими объектами. Их сильная сторона — скорость регистрации сигналов от единичных объектов, например от клеток в суспензии. Обычный коммерчески доступный цитометр работает со скоростью 1000 клеток в секунду, а специализированные высокопроизводительные — до 25 000 клеток в секунду! В стандартном варианте у каждого объекта измеряются от двух до десяти параметров: светорассеяния и флуоресценции одного или нескольких флуорофоров. Таким образом можно получить статистически достоверные результаты по гетерогенности клеточных, в частности микробных, популяций. Существуют также приборы, способные сортировать клетки по определенным параметрам светорассеяния или флуоресценции, чтобы затем изучать субпопуляции с использованием других методов.

…И что из них можно узнать

Итак, все флуоресцентные репортеры имеют специализацию, то есть способны избирательно характеризовать определенные свойства биологической системы. Остановимся вкратце на некоторых категориях «специалистов».

С помощью ряда флуоресцентных репортеров (как правило, органических флуорофоров) можно следить за ферментативным катализом — исследовать динамику ферментативных реакций, их локализацию в клетках, тканях, органах и т. п. Это, например, субстраты с ковалентно присоединенными флуорофорами, которые начинают флуоресцировать только после высвобождения в ходе реакции, или «профлуорофоры», становящиеся флуоресцентными при взаимодействии с продуктом реакции.

Репортеры, сформированные на основе антител — физические комплексы или ковалентные соединения флуорофоров с антителами, — информируют о протекании иммунологических реакций. Флуоресцирующим компонентом может быть любой из известных органических и неорганических флуорофоров, включая квантовые точки. Кроме того, к антителам можно присоединять ферменты, катализирующие реакции с образованием флуоресцирующего продукта. Современные технологии позволяют получить антитела к любому белку (антигену), интересующему исследователя, антитело же с флуоресцентной меткой заставит светиться этот белок или структуру, из него построенную. Например, с помощью флуоресцентных антител выявлены микрофибриллы в фибробластах мышей (см. фото на второй странице обложки).

Очень информативны методы с использованием флуоресцентных белков (ФБ). Мы уже упоминали о том, как полезны методы внедрения в клетку генов гибридных белков, которые заставляют флуоресцировать естественный белок или даже нуклеиновую кислоту. Вдобавок флуоресценция ФБ-содержащих гибридных белков зависит от кислотности среды, что позволяет измерять рН не только внутри клетки, но и внутри отдельных органелл, если такой белок «адресован» в ядро или митохондрию.

Особый интерес вызывает применение ФБ в сочетании с методиками измерения флуоресценции, основанными на безызлучательной передаче энергии. Представьте себе два гибридных белка, один из которых заставляет флуоресцировать другой при сближении. Подобным же образом можно изучать конформационные (структурные) изменения в белках, если присоединить ФБ к разным участкам одной белковой молекулы.

Чувствительность флуоресценции к физическим свойствам микроокружения флуорофоров позволяет использовать некоторых из них в качестве репортеров различных параметров внутриклеточной среды. В их числе, например, вязкость цитоплазмы, внутреннего содержимого органелл, гидрофобного слоя биомембран. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на мембране: с помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала. Существуют даже репортеры для измерения внутриклеточной температуры!

Что высветили в микромире флуоресцентные репортеры

Флуоресцентные репортеры долго и успешно служат во многих, если не во всех областях экспериментальной биологии. Однако есть такие области, где они сыграли ключевую роль.

С использованием флуоресцентных репортеров была экспериментально доказана модель жидкокристаллической структуры всех биологических мембран. Согласно этой модели, при всей ее структурной целостности мембрана достаточно «жидкая», чтобы отдельные ее компоненты могли перемещаться в нужные стороны. Такое представление позволяет понять основные молекулярные механизмы функционирования мембран, а также свойства живых клеток в целом.

В значительной мере благодаря информации от флуоресцентных репортеров прояснились механизмы трансформации энергии в клетках. Особую роль здесь сыграли флуорофоры, позволяющие регистрировать внутриклеточный и внутримитохондриальный рН, а также разность электрических потенциалов на мембранах. С их помощью прежде всего был выявлен механизм сопряжения энергодонорных реакций окисления с энергозатратным синтезом аденозинтрифосфата (АТФ) — универсального поставщика энергии для большинства метаболических процессов. Кроме того, была изучена природа накопления различных веществ в цитоплазме и в клеточных органеллах за счет мембранного электрического потенциала и градиента рН.

Жизнедеятельность клеток обеспечивается совокупностью скоординированных в пространстве и времени биохимических реакций, а за координацию отвечают так называемые сигнальные системы. Основные компоненты этих систем были изолированы и охарактеризованы с помощью методов традиционной биохимии и молекулярной биологии. Однако только подходы, основанные на применении флуоресцентных репортеров, показали напрямую, где пролегают эти пути и как по ним проходят сигналы, — стало возможным в реальном времени следить за взаимодействиями сигнальных белков или оценивать динамику экспрессии генов в отдельно взятой клетке. С помощью флуоресцентных репортеров удалось обнаружить и неизвестные ранее сигнальные компоненты, например выявить роль ионов Са⁺² как сигнального посредника во многих регуляторных реакциях.

Во второй половине ХХ века в микробиологии возникла проблема, которую окрестили «великой аномалией учета микроорганизмов с помощью чашек Петри». «Виновниками» оказались флуоресцентные репортеры, два красителя нуклеиновых кислот — акридиновый оранжевый и 4,6-диамидино-2-фенилиндол. Оценить содержание микроорганизмов в природном образце можно, либо подсчитывая колонии, выросшие на чашке Петри (при достаточном разведении «посевного материала» каждую колонию образуют потомки лишь одной клетки), либо напрямую подсчитывая под микроскопом сами микроорганизмы, прокрашенные флуоресцентными красителями нуклеиновых кислот. Так вот, флуоресцентные репортеры всегда выявляли значительно больше микроорганизмов, чем анализ с чашками Петри.

Для объяснения этого противоречия были выдвинуты две гипотезы. Согласно первой, часть клеток, находящихся в состоянии покоя, не размножается на чашках Петри. Согласно второй, условия культивирования (состав среды, температура и др.) не соответствуют потребностям некоторой части популяции. Проверка этих гипотез показала, что возможно и то, и другое. Более того, был дан толчок к формированию двух новых больших направлений исследований. Первое связано с изучением так называемого жизнеспособного, но некультивируемого состояния микроорганизмов. Понятна практическая значимость таких исследований: например, патогены человека в этом состоянии могут быть невидимы для стандартных методов диагностики и более устойчивы к лекарственным препаратам. Второе направление — выявление и изучение микроорганизмов в природных образцах путем прямого анализа их нуклеиновых кислот, без предварительного получения чистых культур, как это делалось раньше. Это направление получило собственное название — метагеномика. Благодаря методам метагеномики (кстати, некоторые из этих методов предполагают использование флуоресцентных репортеров) появилась возможность по-новому увидеть биологическое разнообразие микроорганизмов в отдельных экосистемах и на Земле в целом.

Итак, современные флуоресцентные репортеры — это огромная армия специалистов, и многие из них уже имеют громкую славу в экспериментальной биологии. Их репортажи позволили лучше разглядеть те уголки микромира, куда может заглянуть свет. Однако многие исследователи, работающие в данной области, считают, что все, увиденное нами в свете флуоресценции до сих пор, — это только начало!

Флуоресценция — Химия LibreTexts

1. Последнее обновление

2. Сохранить как PDF

Флуоресценция, разновидность люминесценции, возникает в газообразных, жидких или твердых химических системах. Флуоресценция вызывается поглощением фотонов в синглетном основном состоянии, переведенным в синглетное возбужденное состояние. Спин электрона по-прежнему связан с электроном в основном состоянии, в отличие от фосфоресценции. Когда возбужденная молекула возвращается в основное состояние, она испускает фотон с меньшей энергией, что соответствует большей длине волны, чем поглощенный фотон.

Потеря энергии происходит из-за колебательной релаксации в возбужденном состоянии. Флуоресцентные полосы центрируются на длинах волн длиннее резонансной линии. Этот сдвиг в сторону более длинных волн называется стоксовым сдвигом. Возбужденные состояния кратковременны со временем жизни около 10 ^-8 секунд. Молекулярная структура и химическая среда влияют на то, люминесцирует вещество или нет. Когда люминесценция возникает, молекулярная структура и химическое окружение определяют интенсивность свечения. Обычно флуоресцирующие молекулы представляют собой сопряженные системы. Флуоресценция возникает, когда атом или молекулы релаксируют посредством колебательной релаксации в свое основное состояние после электрического возбуждения. Конкретные частоты возбуждения и испускания зависят от молекулы или атома.

\[ S_0 + h\nu_{ex} = S_1 \]

где

• \(h\nu\) — энергия фотона с
• \(h\) — постоянная Планка, а
• \(\nu\) — частота света,
• \(S_0\) — основное состояние флуорофора, а
• \(S_1\) является его первым электронно-возбужденным состоянием.

Рис. 1: Диаграмма Яблонского поглощения, безызлучательного распада и флуоресценции. (Общественное достояние, Jacobkhed)

На рисунке 1 представлена ​​энергетическая диаграмма Яблонского, представляющая флуоресценцию. Фиолетовая стрелка представляет собой поглощение света. Зеленая стрелка представляет собой колебательную релаксацию из синглетного возбужденного состояния, S ₂ до S ₁ . Этот процесс представляет собой безызлучательную релаксацию, при которой энергия возбуждения рассеивается в виде колебаний или тепла в растворителе, а фотон не испускается. Желтая стрелка представляет собой флуоресценцию в основном синглетном состоянии S _или .

Квантовый выход флуоресценции ((\Phi\)) определяет эффективность процесса флуоресценции. Это отношение испущенных фотонов к поглощенным фотонам.

\[ \Phi = \dfrac{\text{ # испускаемых фотонов }}{\text{ # поглощаемых фотонов }} \label{Eq0} \]

Если каждый поглощенный фотон приводит к испусканию фотона. Максимальный квантовый выход флуоресценции равен 1,0, а соединения с квантовым выходом 0,10 по-прежнему считаются флуоресцентными. Другой способ определить квантовый выход флуоресценции — это скорость затухания в возбужденном состоянии:

\[ \Phi = \dfrac{k_f}{\sum_i k_i} \label{Eq1}\]

, где \(k_f\) — скорость спонтанного излучения, а знаменатель — сумма всех скоростей затухания в возбужденном состоянии для каждого процесса дезактивации (т.е. конверсия…). Время жизни флуоресценции — это среднее время, в течение которого молекула остается в возбужденном состоянии до испускания фотона. Флуоресценция обычно следует кинетике первого порядка: 9{- t/\tau} \label{Eq2}\]

где

• \([S_1]\) — концентрация молекул в возбужденном состоянии в момент времени \(t\),
• \([S_1]_0\) — начальная концентрация и \(\tau\) — скорость распада.

Различные радиационные и безызлучательные процессы могут опустошать возбужденное состояние, поэтому полная скорость распада представляет собой сумму всех скоростей: скорость, \( \tau_{rad} \) скорость радиационного распада и \(\tau_{nrad} \) скорость безызлучательного распада. Если скорость спонтанного излучения или любая другая скорость высока, время жизни коротко. Среднее время жизни флуоресцентных соединений, излучающих фотоны с энергиями от УФ до ближнего инфракрасного диапазона, находится в диапазоне от 0,5 до 20 наносекунд. 9{-εbc})] \label{Eq4}\]

где

• \(k\) — константа пропорциональности, приписываемая прибору
• \(I_o\( — интенсивность падающего света
• \(\эпсилон\) — молярная поглощательная способность,
• \(b\) — длина пути, а
• \(с\) — концентрация субстрата.

Если используются разбавленные растворы, так что поглощается менее 2% энергии возбуждения, то можно сделать приближение таким образом, чтобы 9{x} \ absx 1 + x + … \]

Таким образом, уравнение \ (\ ref {eq4} \) может быть упрощено до

\ [i_f = ki_o \ phi [εbc] \ label {eq4a} \]

. Эта связь показывает, что флюресцентная доля .

Флуоресценция редко возникает в результате поглощения УФ-излучения с длинами волн короче 250 нм, потому что этот тип излучения обладает достаточной энергией, чтобы вызвать деактивацию возбужденного состояния путем предварительной диссоциации или диссоциации. * \rightarrow \pi\), потому что эти возбужденные состояния имеют короткие средние времена жизни (большие \(k_f\)) и потому что процессы дезактивации, конкурирующие с флуоресценцией, менее вероятны. Молярная поглощающая способность переходов π → π* в 100–1000 раз больше. Средний срок службы 10 9От 0026 -7 до 10 ^-9 секунд для состояний ?, ?* и от 10 ^-5 до 10 ^-7 секунд для состояний n, π*.

Рисунок 2: Схематическое изображение флуоресцентного спектрометра. из OpenStax (CC-BY-3.0)

На рис. 2 представлена ​​схема типичного флуориметра с фильтром, в котором для возбуждения флуоресценции используется исходный пучок, а в качестве преобразователей — пара фотоумножителей. Исходный пучок разделяется вблизи источника на опорный пучок и пробный пучок. Опорный пучок ослабляется апертурным диском, так что его интенсивность примерно равна интенсивности флуоресценции. Оба луча проходят через первичный фильтр, при этом опорный пучок отражается на опорный фотоумножитель. Луч образца фокусируется на образце парой линз и вызывает флуоресцентное излучение. Испускаемое излучение проходит через второй фильтр и затем фокусируется на фотоумножителе образца. Электрические выходы от двух преобразователей затем обрабатываются аналого-цифровым преобразователем для вычисления отношения интенсивностей образца к эталонным, которые затем можно использовать для качественного и количественного анализа. Для получения спектра излучения монохроматор возбуждения фиксируется, а монохроматор излучения изменяется. Чтобы получить спектр возбуждения, монохроматор возбуждения изменяется, а монохроматор излучения фиксирован.

Спектроскопию флуоресценции можно использовать для измерения концентрации соединения, поскольку интенсивность флуоресценции линейно пропорциональна концентрации флуоресцентной молекулы. Флуоресцентные молекулы также могут быть использованы в качестве меток. Например, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это метод определения того, какие гены присутствуют в геноме организма. Одноцепочечная ДНК, кодирующая интересующий ген, ковалентно связана с флуоресцентной молекулой и омывается хромосомой организма, связываясь с ее комплементарной последовательностью. Присутствие и размещение гена в организме затем флуоресцирует при освещении ультрафиолетовым светом. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) используется в молекулярной биологии для мониторинга активности белков. Ген, кодирующий GFP, может быть вставлен рядом с геном, кодирующим белок, который будет изучаться. Когда гены экспрессируются, белок будет присоединен к GFP и может быть идентифицирован в клетке по его флуоресценции.

Fluorescence распространяется под лицензией CC BY 4.0, авторами, ремиксами и/или кураторами являются Зои Смит и Кристина Роман.

1. Наверх

• Была ли эта статья полезной?

1. Тип изделия

   Раздел или Страница

   Лицензия

   СС BY

   Версия лицензии

   4,0

   Показать страницу TOC

   № на стр.

2. Теги

   1. автор@Кристина Роман
   2. автор@Зои Смит
   3. флуоресцентный

Что такое флуоресцентное освещение?

Флуоресцентное освещение. Вы, наверное, уже имеете представление о том, что это такое. Может быть, вы даже немного понимаете, как это работает.

Конечно, известно, что флуоресцентное освещение вредит глазам и портит цвет лица.

Но флуоресцентное освещение имеет гораздо больше, чем не совсем идеальные побочные эффекты, включая некоторые приятные преимущества.

Вот что мы обсуждаем в этом посте:

• Как работают люминесцентные лампы
• Зачем люминесцентным лампам нужен балласт
• Где использовать линейные люминесцентные лампы
• Плюсы и минусы линейных люминесцентных ламп

Что такое флуоресцентное освещение?

Флуоресцентное освещение — это очень универсальный тип освещения, с которым вы, скорее всего, столкнетесь в офисе, школе или продуктовом магазине. Он известен своей энергоэффективностью по сравнению с лампами накаливания и галогенными лампами и более низкой ценой по сравнению со светодиодами.

Существует несколько различных типов люминесцентных ламп, включая линейные люминесцентные лампы, изогнутые люминесцентные лампы, круглые люминесцентные лампы и компактные люминесцентные лампы.

В этом посте мы сосредоточимся на линейных люминесцентных лампах из-за их популярности. Люминесцентные лампы обычно используются в потолочных светильниках, таких как трофферы, во всех типах коммерческих зданий.

Как работают люминесцентные лампы?

Флуоресцентное освещение зависит от химической реакции внутри стеклянной трубки для создания света. Эта химическая реакция включает взаимодействие газов и паров ртути, в результате чего возникает невидимый ультрафиолетовый свет. Этот невидимый ультрафиолетовый свет освещает люминофорный порошок, покрывающий внутреннюю часть стеклянной трубки, излучая белый «флуоресцентный» свет.

Вот более подробное описание процесса:

Сначала электричество поступает в светильник, как троффер, и через балласт. Балласт, который регулирует напряжение, ток и т. д. и необходим для работы люминесцентной лампы, подает электричество на контакты люминесцентной лампы на обоих концах.

Подробнее: Что такое балласт и как он работает?

Затем, после того как электричество проходит через контакты, оно течет к электродам внутри герметичной стеклянной трубки, которая находится под низким давлением. Электроны начинают путешествовать по трубке от одного катода к другому.

Внутри стеклянной трубки находятся инертные газы и ртуть, которые возбуждаются электрическим током. Ртуть испаряется по мере прохождения электричества, и газы начинают реагировать друг с другом, создавая невидимый ультрафиолетовый свет, который мы на самом деле не можем увидеть невооруженным глазом.

Но мы, очевидно, замечаем люминесцентные лампы, излучающие свет, так что же именно мы видим?

Каждая люминесцентная лампа покрыта люминофорным порошком. Если вы засунете палец в тюбик и потрете его внутреннюю часть, это будет выглядеть так, как будто вы только что насладились пончиком в порошке.

Это люминофорное покрытие светится, когда оно возбуждается невидимым ультрафиолетовым светом, и это то, что мы видим своими глазами — светящийся люминофорный порошок, создающий «белый свет». Отсюда и термин «флюоресцентный» — «светящийся белым светом».

Из-за того, что в люминесцентных лампах содержится ртуть, важно утилизировать ваши лампы после того, как они перегорели. У нас есть услуга по переработке, которая позволяет легко и быстро убрать старые перегоревшие лампы из вашего шкафа и выбросить их из головы. Мы также продаем ящики для вторсырья.

Зачем люминесцентным лампам балласт?

Основное назначение балласта — улавливать переменный ток, проходящий по проводам в ваших стенах — буквально волнами, вверх и вниз — и превращать его в постоянный и прямой поток электричества. Это стабилизирует и поддерживает химическую реакцию, происходящую внутри колбы.

Чтобы выбрать правильный балласт для ваших ламп, вам необходимо ответить на следующие три вопроса:

1. Какой тип лампы требует питания? (Например, это Т8, Т5? 4 фута? 2 фута? и т. д.)
2. Сколько ламп нужно питание?
3. Какое напряжение поступает на прибор?

Балласты влияют на потребление энергии с помощью так называемого коэффициента балласта. Узнайте больше о коэффициенте балласта и о том, как он влияет на потребление энергии, здесь.

Почему флуоресцентные лампы становятся розовыми и оранжевыми?

Если вы посмотрите на большую комнату, освещенную в основном люминесцентными лампами, то, скорее всего, вы увидите всевозможные цвета, исходящие от потолка. Почему?

Эта концепция называется «изменение цвета». Чем дольше горят флуоресцентные лампы, тем больше вероятность того, что химические свойства изменятся и вызовут несбалансированную реакцию, в результате чего флуоресценция станет менее белой и менее яркой, чем раньше.

Если постоянство действительно важно для вашего проекта освещения, вы можете рассмотреть возможность групповой замены этих ламп. Заменяя все трубки партиями, вы можете решить проблему несовместимости цветов и яркости в вашем пространстве.

Еще одним соображением является обновление светодиодов для ваших ламп. О вариантах светодиодных трубок T8 мы рассказываем в этой статье.

В чем разница между линейными люминесцентными лампами и компактными люминесцентными лампами?

Для пояснения: как линейные, так и компактные люминесцентные лампы используют одну и ту же технологию для получения искусственного света. Самая большая разница заключается в форм-факторе — или размере и конфигурации — ламп КЛЛ.

Компактные люминесцентные лампы (КЛЛ) представляют собой усовершенствование технологии линейных люминесцентных ламп, потребляющих меньше энергии. Они также предназначены для ввинчивания в обычную розетку накаливания или для подключения к утопленной банке. Их часто называют «пружинными лампами» или «подключаемыми» компактными люминесцентными лампами в зависимости от назначения и формы 

Узнайте больше о компактных люминесцентных лампах в нашей статье  «Что такое лампы компактных люминесцентных ламп и где их следует использовать?»

Где вы используете линейное люминесцентное освещение?

Хотя люминесцентные лампы используются в самых разных областях, они не везде хорошо работают. Наиболее распространенной причиной, по которой люди используют люминесцентные лампы, является экономия энергии с минимальными первоначальными затратами.

Вот некоторые типичные области применения линейного люминесцентного освещения:

Коммерческие офисы

Как правило, офисные помещения не слишком озабочены декоративным и акцентирующим освещением. Основным приоритетом является общее освещение, функциональное для офисной среды. Из-за этого линейные люминесцентные лампы являются основными лампами, используемыми в офисных помещениях в США.

Склады

Если вы не знакомы с высокопроизводительными Т5, вам необходимо это сделать. Эти лампы могут работать до 90 000 часов и производить больше света (люменов), чем более толстые линейные люминесцентные лампы, такие как T12 и T8. Из-за этого они являются отличным выбором для складов или любых высоких потолков, где требуется значительное количество света.

Больницы

Подобно офисным помещениям, в больницах также используются линейные люминесцентные лампы для экономии энергии и получения белого, чистого и эффективного источника света.

Магазины розничной торговли

При создании уникального дизайна освещения для розничной торговли мы рекомендуем правило 20/80 — 20 процентов вашего освещения должно быть декоративным и уникальным (например, настенные бра, люстры, облачные чаши). И 80 процентов из них должно составлять стандартное общее освещение.

В универмагах, таких как Macy’s, JC Penney, Kohl’s и Target, 80-процентное общее освещение является основной территорией для линейных флуоресцентных ламп.

Плюсы и минусы линейных люминесцентных ламп

Плюсы линейных люминесцентных ламп

• Энергоэффективность

  При переходе с ламп накаливания или галогенных ламп на линейные люминесцентные лампы вы можете рассчитывать на 40-процентную экономию на ваш счет за электроэнергию.

• Разнообразие цветовых температур

  Если вам нужно пространство с действительно «холодной температурой», например, в коридоре больницы или на станции метро, ​​флуоресцентные лампы обеспечивают цветовую температуру до 6500 Кельвинов. Хотя существует не так много приложений, требующих такого холодного света, диапазон цветов от теплого до холодного является точкой гибкости для флуоресцентных ламп.

• Стоимость

  По сравнению со светодиодами линейные люминесцентные лампы более доступны по цене. Светодиод, по сути, привел к снижению цен на флуоресцентные лампы за последние несколько лет.

Линейные флуоресцентные лампы

• Изменение цвета или ослабление светового потока

  Как мы упоминали выше, чем дольше горят флуоресцентные лампы, тем больше вероятность того, что химические свойства изменятся, что вызовет несбалансированную реакцию, в результате чего флуоресценция станет менее белой и менее яркой, чем раньше. Светоотдача снижается, и со временем ваше освещение может выглядеть как лоскутное одеяло.

• Резкий свет

  Люминесцентные лампы вредны для глаз! Если вы обнаружите, что ваши глаза часто налиты кровью или сохнут, вы можете оценить источник света, под которым вы находитесь большую часть дня.